Un laboratorio de aguas procesa 50 muestras al mes con un método que lleva doce años en la casa. Nadie duda de él. Llega la evaluación de acreditación y el evaluador pide una sola cosa: el expediente de validación de método. Aparecen cartas de control, certificados de calibración, un procedimiento impecable. No aparece ni una estimación de precisión ni un ensayo de sesgo contra un material de referencia. Doce años de buen trabajo sin una cifra que lo demuestre.

Cuatro partes revisadas por el mismo comité

Las cuatro salieron del Comité Técnico ISO/TC 69, Aplicación de los métodos estadísticos, Subcomité SC 6, lo que garantiza que las definiciones no se contradigan. Tres venían de 1994; la parte 2 iba un ciclo por delante.

ISO 5725-1: el marco que le da sentido a la validación de método

La parte 1 no trae fórmulas de trabajo diario. Trae definiciones, y en metrología las definiciones son la mitad del problema.

Define exactitud (3.5) como la proximidad de acuerdo entre un resultado de ensayo y el valor verdadero, y aclara en su Nota 3 que combina veracidad y precisión. La veracidad (3.6) es la proximidad entre la expectativa de los resultados y un valor verdadero, y se expresa como sesgo. Ambas vienen de ISO 3534-2:2006. Como el valor verdadero no se conoce, la norma lo sustituye por el valor de referencia aceptado: ese reemplazo vuelve la validación de método un ejercicio real y no filosófico.

Las tres precisiones, con un litro de leche

Tienes un método para determinar proteína en leche y quieres saber cuánto varía. Hay tres respuestas, y no son intercambiables.

Repetibilidad. Mides la misma muestra cinco veces el mismo día: el mismo analista, el mismo equipo, el mismo lote de reactivos, la misma jornada. Obtienes 3,15 % / 3,17 % / 3,14 % / 3,16 % / 3,18 %. Los resultados casi se tocan. Es la variabilidad mínima, el ruido que no puedes quitar aunque congeles todas las condiciones.

Precisión intermedia. Misma leche, mismo laboratorio, pero ahora la miden tres analistas distintos, en días distintos, con dos equipos. Obtienes 3,12 % / 3,19 % / 3,21 % / 3,13 %. La dispersión crece, y queda en medio. Sigues en tu casa: cambió todo menos el laboratorio.

Reproducibilidad. Divides esa leche y la mandas a varios laboratorios, cada uno en su propia sede. Vuelven 3,10 % / 3,22 % / 3,18 % / 3,09 %. Es la variabilidad máxima: cambia todo lo que puede cambiar, el laboratorio incluido.

Veracidad y sesgo: por qué la norma usa los dos

Lo cuenta la introducción de ISO 5725-1. El término sesgo lleva muchísimo tiempo en uso estadístico, pero provocó objeciones filosóficas entre miembros de algunas profesiones — la norma menciona a médicos y a profesionales del derecho —, así que se enfatizó el aspecto positivo inventando el término veracidad.

Cuidado con la lectura fácil: no hubo sustitución. La veracidad es la propiedad; el sesgo es su medida. La definición 3.6 lo dice en su Nota 1: la medida de la veracidad se expresa de forma habitual en términos de sesgo. Por eso ISO 5725-4 se titula determinación de la veracidad y por dentro sus cláusulas operativas hablan de sesgo del método y de sesgo de laboratorio. Hablas de veracidad; calculas sesgo. Nadie reporta veracidad en mg/L.

¿La reproducibilidad exige laboratorios distintos?

Es la duda que más aparece en consultoría, y la norma la resuelve sin ambigüedad. ISO 5725-3 (0.3) enumera los factores que mueven un resultado: a) el laboratorio, b) el operador, c) el equipo, d) la calibración, e) el lote de reactivo, f) el tiempo entre mediciones, g) el entorno y h) otros. Las tres condiciones de precisión se definen por cuáles de esos factores dejas sueltos.

La respuesta corta: si cambias analista, equipo, día o lote dentro de tu laboratorio, no estás midiendo reproducibilidad. Estás midiendo precisión intermedia. La definición formal cierra la puerta: ISO 5725-1 (3.19) establece las condiciones de reproducibilidad como aquellas en que se obtienen resultados independientes con el mismo método, sobre elementos idénticos, en diferentes instalaciones de prueba o medición, con diferentes operadores y utilizando equipos diferentes. Instalaciones distintas, en plural.

El matiz que casi nadie cita

Ahora la respuesta larga, que sí abre una puerta. ISO 5725-2 (6.2.2) define «laboratorio» de forma operativa: una combinación de operador, equipo y lugar de ensayo. Y añade que un lugar de ensayo — un laboratorio en el sentido convencional — puede producir varios «laboratorios» si puede proporcionar varios operadores, cada uno de ellos con conjuntos independientes de equipos y situaciones en las que realizar el trabajo.

En nuestra experiencia esa puerta es más estrecha de lo que parece, porque exige independencia real. Dos salas con instrumental y personal propios pueden aportar dos «laboratorios». Una sala con un solo cromatógrafo y tres analistas por turnos aporta uno, por mucho que roten: si compartes el equipo compartes su sesgo, y ese es justo el componente que la reproducibilidad pretende capturar.

Cómo medir la precisión intermedia en tu propia casa

ISO 5725-3 (6.2.1) da el procedimiento más sencillo: toma una muestra — o un conjunto de muestras idénticas, si el ensayo es destructivo — y haz una serie de n mediciones cambiando el factor o los factores entre cada una. Recomienda que n sea al menos 15. Sirve para estudiar la precisión intermedia en el tiempo midiendo la misma muestra en días sucesivos, o el efecto de la calibración entre medidas.

Un riesgo que la norma advierte: si modificas más de un factor a la vez quedan confundidos, y tendrás un número sin saber cuál pesa. Separarlos exige los diseños de la parte 3.

Sobre cuánto esperar, ISO 5725-3 (0.4) da órdenes de magnitud: en análisis químico la precisión intermedia puede ser dos o tres veces la repetibilidad, y nunca debería superar la reproducibilidad.

Y si vas a montar el estudio colaborativo, no hay un número mágico de participantes: la tabla 1 de ISO 5725-3 sitúa lo habitual entre 4 y 15 laboratorios, y señala que algunos de sus diseños especiales dan estimaciones fiables con tan solo cuatro.

Puente con ISO 17025. Aquí está la buena noticia. NTC-ISO/IEC 17025, 7.2.2.1, nota 2, lista seis técnicas de validación y las comparaciones interlaboratorio son solo la e); la a) es la evaluación del sesgo y la precisión con patrones o materiales de referencia, y la b) la evaluación sistemática de los factores que influyen en el resultado. Y la nota de 7.2.2.3 habla de «la repetibilidad o la reproducibilidad» entre las características de desempeño. La norma no te obliga a reclutar laboratorios ajenos: te obliga a demostrar el desempeño que tu aplicación necesita.

ISO 5725-2: el experimento que pone número a la precisión

Es la parte que más se usa y la que más se cita mal. Su alcance es estrecho a propósito: estima solo la desviación típica de repetibilidad y la de reproducibilidad, mediante un diseño interlaboratorio donde cada participante mide la misma muestra varias veces en condiciones de repetibilidad.

Lo que declara que no hace es tan útil como lo que hace. No cubre diseños anidados, factoriales ni de niveles divididos. No cubre precisión intermedia: eso es ISO 5725-3. No cubre veracidad: eso es ISO 5725-4. No cubre incertidumbre: remite a ISO 21748. Y acota el método a mediciones en escala continua con un valor único. Si tu ensayo es cualitativo, este no es tu documento.

El caso ideal es p laboratorios ensayando q niveles con n réplicas. En la vida real faltan datos y el diseño se desequilibra; la norma lo asume y su anexo C incluye ejemplos con réplicas variables por celda.

Cómo la norma limpia los datos antes de calcular

Aquí está el valor real de ISO 5725-2. El análisis va en tres etapas: examen crítico de los datos, valores preliminares por nivel y valores finales.

El anexo C da escala: en el ejemplo del punto de ablandamiento del alquitrán participan 15 y 16 laboratorios con dos réplicas, y los valores críticos de Cochran al 5 % son 0,471 y 0,452.

Un detalle de gestión que suele pasarse por alto: el operador debe ser representativo de quien hace el ensayo en la rutina, y hay que explicarle que el objetivo es medir cuánto varían los resultados en la práctica, no lucirse.

Puente con ISO 17025. El apartado 7.2.2.4 exige conservar cinco registros de validación: el procedimiento utilizado, la especificación de los requisitos, la determinación de las características de desempeño, los resultados obtenidos y una declaración de la validez del método detallando su aptitud para el uso previsto. ISO 5725-2 llena los tres del medio con s_r, s_R, los límites r y R, el tratamiento de aislados y aberrantes, y los formularios A, B y C.

ISO 5725-3: separar la variabilidad en sus factores

Es la que más cambió: incorpora diseños de matriz ortogonal, de niveles divididos, para material heterogéneo y con múltiples niveles, y suma consideraciones sobre selección de factores y modelado de efectos factoriales.

Su objetivo va más allá de nombrar la precisión intermedia: busca descomponerla. Identificar qué aporta el tiempo, qué la calibración, qué el operador y qué el equipo, cuantificar cada componente y, cuando se pueda, reducirlo. Trabaja solo con efectos aleatorios: modelar un factor como efecto fijo es razonable apenas después de un estudio de optimización o de calibración.

El análisis se apoya en Máxima Verosimilitud Restringida (REML), que exige software estadístico; si no lo tienes, la norma admite ANOVA en su anexo C.

Puente con ISO 17025. El apartado 7.6.1 pide identificar las contribuciones a la incertidumbre y tener en cuenta todas las que sean significativas. Un presupuesto que dice «variabilidad del método: 0,52» identifica poco. Uno que separa operador, equipo y día identifica de verdad, y es lo que ISO 5725-3 permite construir.

ISO 5725-4: la veracidad y el tamaño real del experimento

Responde la pregunta que la precisión nunca contesta: ¿tus resultados están donde deben estar? Su medida es el sesgo, y distingue dos que no se deben mezclar.

• Sesgo del método. El que persiste dondequiera y cuandoquiera que se aplique. Investigarlo exige muchos laboratorios.
• Sesgo de laboratorio. El tuyo, revelado con mediciones dentro de una sola casa. Ojo con la advertencia: vale solo para el momento del experimento y los niveles investigados, y exige pruebas periódicas para demostrar que no varía.

El cambio de fondo de esta 2.ª edición apunta a los materiales: reconoce los requisitos de los valores de referencia aceptados e introduce sus incertidumbres en el cálculo. El valor de referencia debe ser confiable y metrológicamente trazable, y su incertidumbre tiene componentes que muchos certificados no declaran juntos: caracterización o calibración, heterogeneidad, inestabilidad y el propio sesgo.

Antes de evaluar tu sesgo de laboratorio, la norma exige un paso que casi nadie da: comprobar tu desviación típica intralaboratorio contra la de repetibilidad declarada del método. Si tu ruido interno no se parece al del método, el sesgo que calcules no significa lo que crees.

Cuántos laboratorios necesitas de verdad

Para que el experimento detecte con alta probabilidad un sesgo de valor absoluto δ_m, debe cumplirse A·σ_R ≤ δ_m/1,84, donde A depende del número de laboratorios p, del número de resultados por laboratorio n y de la incertidumbre del valor de referencia.

Su tabla 1 pone cifras. Con dos resultados por laboratorio y una incertidumbre del valor de referencia despreciable, A vale 0,62 con 5 laboratorios, 0,44 con 10, 0,36 con 15, 0,31 con 20 y 0,22 con 40. Traducción práctica: pasar de 5 a 10 mejora mucho; de 30 a 40 casi no mueve la aguja. El dinero está en los primeros participantes.

La decisión final es un intervalo de confianza: se calcula el de 0,95 para el sesgo y se compara con cero. Si lo contiene, el sesgo es insignificante a α = 0,05.

Y una consecuencia de gestión poco comentada: cuando el sesgo resulta insignificante solo en ciertos niveles, el grupo de expertos puede sugerir reducir el rango de trabajo del método. La validación de método no siempre termina en aprobado; a veces termina en aprobado con alcance recortado.

Puente con ISO 17025. Conecta con 6.5, trazabilidad metrológica, que exige una cadena ininterrumpida y documentada de calibraciones hacia una referencia apropiada — y admite de forma explícita los valores certificados de materiales de referencia certificados de productores competentes. Y con 7.7.1, que pide un procedimiento de seguimiento de la validez con materiales de referencia, gráficos de control y repetición de ensayos. El sesgo no se mide una vez: se vigila.

Caso práctico: precisión de un método HPLC según ISO 5725-2

Escenario hipotético con cifras plausibles, construido para ilustrar el flujo de trabajo. No corresponde a un estudio publicado.

Contexto. Un laboratorio de alimentos quiere acreditar la cuantificación de sulfatiazol en carnes con un método HPLC propio, tres años de uso y sin expediente.

Diseño. Convoca 10 laboratorios competentes en residuos veterinarios. Prepara 5 niveles de carne fortificada — 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 y 10 µg/kg — y cada participante mide 3 réplicas por nivel en condiciones de repetibilidad: p = 10, q = 5, n = 3, o sea 150 resultados.

Examen crítico. Antes de calcular nada, Cochran a las varianzas y Grubbs a las medias de celda, con los gráficos h y k de Mandel como apoyo. Un laboratorio muestra varianza aberrante en el nivel más bajo; se investiga y aparece la explicación técnica — columna al final de su vida útil —. Se descarta esa celda y se documenta la razón.

Resultado. En el nivel de 2,0 µg/kg se obtiene s_r = 0,18 µg/kg y s_R = 0,52 µg/kg. La relación s_R/s_r ≈ 2,9 dice que el cambio de laboratorio pesa bastante más que el ruido interno, sin inutilizar el método.

Qué queda documentado. Formularios A, B y C; las pruebas con sus valores críticos; el dato descartado con su justificación; y la tabla final de s_r y s_R por nivel. El método queda validado en precisión. La veracidad es otro experimento.

Errores comunes que cuestan hallazgos

Cómo montar la validación de método sin morir en el intento

Empieza por el inventario. ISO 17025 obliga a validar los métodos no normalizados, los desarrollados por el laboratorio y los normalizados usados fuera de su alcance o modificados (7.2.2.1). El resto se verifica antes de usarlo, conservando registros (7.2.1.5): verificar es otra cosa y cuesta mucho menos.

Decide el alcance antes que el diseño. La validación debe ser tan amplia como sea necesaria para la aplicación. Si tu método solo se usa en una sede, con un equipo y dos analistas, la precisión intermedia describe tu realidad mejor que una reproducibilidad prestada de un estudio ajeno.

Arma el grupo, no el héroe. ISO 5725-1 pide que la planificación sea tarea de un grupo de expertos familiarizados con el método, con al menos un miembro con experiencia en diseño estadístico. Ese grupo responde antes de mover una muestra las diez preguntas del apartado 6.1.2: cuántos laboratorios, qué rango de niveles, cuántas réplicas, en qué plazo y qué garantiza que todos midan elementos idénticos.

Elige laboratorios como manda la norma. Al azar entre quienes usan el método, y es tajante: no solo quienes ganaron experiencia especial durante la normalización, ni laboratorios de referencia elegidos para lucir de lo que el método es capaz en manos expertas.

Convierte la validación en vigilancia. Materiales de referencia, gráficos de control, repetición de ensayos. La estimación de sesgo caduca: vale para el momento y los niveles en que se hizo.

Las cuatro partes de ISO 5725 comparadas

Si te quedas con una sola imagen de este artículo, que sea esta.

La pregunta que deja abierta este artículo: si mañana llega el evaluador y te pide el expediente de validación de método de tu ensayo más rentable, ¿le entregas cifras o le entregas confianza?

Hablemos de tu caso

En Prisma Consultoría acompañamos laboratorios en diagnóstico de vacíos de validación, diseño de experimentos conforme a ISO 5725, análisis estadístico y armado del expediente que el organismo de acreditación va a revisar.

[ENLACE INTERNO: Estimación de incertidumbre de medición en laboratorios acreditados — cómo pasar de s_r, s_I y s_R a la incertidumbre expandida con ISO 21748]